Isolasi DNA dan Gen

Isolasi DNA merupakan teknik dasar yang harus dikuasai dalam teknologi DNA rekombinan. Tujuan isolasi adalah mendapatkan DNA tanpa debris sel. Organisme tingkat rendah, seperti bakteri dan lain-lain (sel prokariot), dan mahluk hidup tingkat tinggi, seperti manusia, hewan, tumbuhan dan lain-lain (sel eukariot) merupakan sumber DNA. Pada sel eukariot, seperti yang telah dibahas sebelumnya, terdapat DNA di dalam inti sel dan DNA dalam organel-organel sel lainnya. Teknik isolasi DNA telah dikenal sejak dahulu kala. Salah satu teknik isolasi adalah secara mini prep (mini-preparation) dan isoalsi DNA secara big prep (big-preparation). Beberapa peneliti sering menggunakan kedua teknik ini dengan berbagai modifikasi yang disesuaikan dengan kondisi lingkungan. Rujukan kedua proses dapat dilihat pada buku Molecular Cloning Laboratory Manual yang ditulis oleh Sambrok dan kawan-kawan. Teknik isolasi lain untuk mendapatkan gen/fragmen gen spesifik dapat dilakukan melalui teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Prinsip teknik isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang berbeda-beda setiap tahapnya. Tahap pertama adalah penghancuran dinding sel. Tahap ini dapat dilakukan secara mekanis dan secara enzimatis. Cara mekanis yang sering dilakukan adalah teknik sonikasi, high pressure distruption dan mencairkan dalam keadaan dingin. Sedangkan cara enzimatis yang umum dilakukan adalah penggunaan lisozim. Saat ini kedua teknik ini sering digabungkan dengan beberapa modifikasi perlakuan. Tahap kedua adalah lisis sel. Proses ini dapat dilakukan dalam berbagai cara, tergantung pada jenis selnya. Sel-sel lunak dapat disuspensi dengan mudah menggunakan bufer non-osmotik. Sedangkan sel-sel yang kuat dapat dilisis dengan penambahan detergen yang keras seperti Triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pada sel eukariot proses ini sering digabung dengan tujuan dapat merusak membran inti tempat asam nukelat. Tahap ketiga adalah membersihkan debris sel. Proses ini sering dilakukan dengan cara sentrifugasi. Campuran molekul, seperti protein, DNA, dan lain-lain, merupakan hasil sentrifugasi. Protein dapat dipresipitasi dengan menggunakan fenol atau solven organik, seperti kloroform dan lain-lain atau proteinnya dihancurkan dengan enzim proteinase. Pemisahan DNA dapat dilakukan dengan mengambil supernatan cairan hasil tahap ini dan dapat dipresipitasi dengan penambahan alkohol. Untuk keperluan rekayasa genetika, ahli rekayasa genetika biasanya menyiapkan paling sedikit dua jenis DNA yang berbeda, yaitu DNA obyek penelitian dan DNA vektor sebagai perantara. DNA plasmid merupakan vektor bagi gen berukuran kecil sedangkan DNA fag merupakan vektor bagi gen yang berukuran besar. Teknik-teknik yang telah disebutkan di atas dapat digunakan untuk mengisolasi berbagai jenis DNA tersebut. Bila pada satu organisme terdapat dua jenis DNA, misalnya DNA kromosom dan DNA plasmid, maka keduanya harus dipisahkan bila hanya ingin mendapatkan salah satunya. DNA tersebut dapat dipisahkan berdasarkan struktur tersiernya. DNA plamid mempunyai struktur yang sangat ketat yang dikenal dengan covalenthy closed circular (ccc). Struktur yang sama juga dimiliki oleh DNA mitokondria. Sedangkan DNA kromosom mempunyai struktur yang lebih longgar dan mempunyai ukuran yang sangat panjang. Perbedaan struktur ini dapat digunakan untuk memisahkan berbagai jenis DNA tersebut melalui proses denaturasi dan pemisahan dengan gradien densitas sentrifuga. Proses denaturasi pada DNA ccc sangat sukar dan bila terjadi DNA tersebut akan cepat mengalami renaturasi. Sebaliknya terjadi pada DNA kromosom. Berdasarkan sifat ini kedua jenis DNA dapat dipisahkan satu dengan yang lain. Pemisahan melalui gradien densitas sentrifuga, dilakukan karena kemampuan DNA berikatan dengan EtBr karena struktur DNA kromosom terbuka. Ikatan ini menyebabkan DNA kromosom menjadi lebih padat. DNA ccc mempunyai struktur tertutup sehingga sukar membentuk khelat atau berinterkelasi dengan basa di dalam molekul tersebut. Akibatnya struktur DNA kurang padat. Berdasarkan perberdaan reaksi ini maka kedua jenis DNA tersebut dapat dipisahkan. Selain teknik isolasi DNA, para ahli rekayasa genetika juga harus menguasai teknik isolasi gen. Teknik ini secara sederhana dapat dipelajari dari proses isolasi gen bakteri E. coli. Teknik ini diawali dengan fragmentasi sel bakteri dan mengisolasi kromosom. Selanjutnya DNA dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Hasil reaksi ini adalah berbagai fragmen DNA. Selanjutnya fragmen tersebut dicampur dengan DNA plasmid E. coli yang telah dipotong dengan enzim restriksi tertentu. Kemudian tambahkan enzimn ligase untuk mengkatalis reaksi penyambungan fragmen DNA dan DNA vektor. Hasilnya adalah berbagai molekul DNA rekombinan dalam bentuk siklik. Kumpulan DNA rekombinan ini merupakan pustaka gen yang dapat dimanfaatkan untuk isolasi gen yang diinginkan. Teknik isolasi ini telah diterapkan untuk memisahkan gen Bt (Bacillus thuringiensis) yang mengintruksi sel tanaman untuk memproduksi protein bersifat racun terhadap ulat bulu, tapi ramah bagi mahluk hidup lain. Demikian juga untuk mendapatkan gen pemicu dapat hidup di air beku dari ikan flounder dan gen pemicu pertumbuhan ikan salmon digunakan teknik isolasi rekayasa genetika.

Collaborators

  • Smithsonian
  • UNIPA
  • UB
  • IBRC

Fundings:

  • USAID